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南昌大学李响敏团队SENSOR ACTUAT B-CHEM：基于脲酶诱导金纳米花金属化的赭曲霉毒素A比色ELISA检测

作者：    来源：    时间：2024-10-30
   

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南昌大学中德联合研究院裴可团队于“Sensors and Actuators B: Chemical ”发表一篇名为“Colorimetric ELISA based on urease catalysis curcumin as a ratiometric indicator for the sensitive determination of aflatoxin B1 in grain products”的文章。

摘要

本研究报道了一种新的酶诱导金属化等离子体酶联免疫吸附试验（pELISA），用于超灵敏检测大米、玉米、小麦和白酒样品中的赭曲霉毒素A（OTA）。使用OTA标记的脲酶作为竞争抗原将尿素水解成氨。在氨分子存在下，银离子被葡萄糖的甲酰基还原，在金纳米花（33 nm，AuNFs）的表面上产生银壳。溶液的颜色从蓝色变为棕红色。研究并优化了影响比色pELISA灵敏度的各种参数。在优化条件下，比色pELISA对肉眼定性检测OTA表现出高灵敏度，截止限为40 pg/mL，对OTA定量检测表现出良好的线性范围为5.0-640 pg/mL，检测限为8.205 pg/mL。这些值比基于辣根过氧化物酶（HRP）的ELISA低15.6倍和14.3倍。该方法还显示出对其他四种真菌毒素的优异特异性，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1和黄曲霉毒素B1。此外，OTA加标大米、玉米、小麦和白酒样品的回收率在81.5%至106%之间，变异系数在6.13%至18.7%之间。这些结果与超高效液相色谱荧光检测器（UPLC-FLD）方法获得的结果非常一致。因此，所提出的方法对于定量检测不同食品样品中的OTA表现出优异的稳健性和可靠性。本工作为食品安全监测中真菌毒素或其他污染物的定性或定量检测提供了一种简单、灵敏、稳健、高通量的筛选方法。

研究内容

一、可行性验证

使用对苯二酚作为还原剂，通过晶种生长方法合成了AuNFs。基于TEM图像，合成的AuNFs表现出33±4 nm的平均直径和7±2 nm的尖端长度（图1A）。动态光散射（DLS）分析表明，平均流体动力学直径为35nm（图1A的插图）。所得AuNFs用0.02%柠檬酸三钠溶液洗涤以交换AuNFs表面上的氢醌配体，因为银离子可以被氢醌直接还原成金属银。将AgNO3、葡萄糖、NH3及其组合与AuNFs溶液混合，并在37℃孵育40分钟，以观察颜色变化并证明NH3诱导的颗粒表面银金属化的可行性。图1B显示只有AgNO3+葡萄糖+NH3+AuNFs产生从蓝色到棕红色的显著颜色变化。相应的TEM图像显示AuNFs的尖端消失。银金属化（AuNFs@Ag）后，AuNFs具有不规则的球形形状和43±7 nm的平均直径（图1C）。DLS分析表明，Ag@AuNFs的平均流体动力学直径增加到42 nm（图1C的插图）。AuNFs@Ag的能量色散X射线元素映射图像显示了一个额外的Ag峰，而AuNFs的能量色散X射线元素映射图像仅显示Au峰（图1D）。这些结果表明，在葡萄糖和AgNO3存在下，NH3可以诱导AuNFs表面的银金属化。

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图1.银沉积前和银沉积后AuNFs(A)的TEM图像和DLS图像.(B)将不同的试剂添加到i)AgNO3(10mM)+葡萄糖(0.2M)+AuNFs(0.105nM)的每个管中;ii)AgNO3(10mM)+氨(400M)+AuNFs(0.105nM);iii)葡萄糖(0.2M)+氨(400M)+AuNFs(0.105nM);iv)AgNO3(10mM)+葡萄糖(0.2M)+氨(400M)+AuNFs(0.105nM);（D）AuNFs和AuNFs@Ag的EDX光谱（标记了银和金峰）。

此外，向含有葡萄糖和AgNO3的AuNFs溶液中加入不同量的NH3。如图2A所示，AuNFs@Ag溶液的LSPR峰表现出显著的蓝移，相应的吸光度增强。这一发现表明，AuNFs上银壳的厚度随着NH3浓度的增加而增加。AM/A0的比率与NH3浓度的对数表现出良好的线性关系，范围从0 M到500 M（R2=0.9987，图2B）。NH3浓度相对于AM/A0变化的LOD为12.5 M。基于产生高于空白信号的AM/A0的NH3最低浓度加上三个标准偏差计算LOD。在NH3浓度为62.5 M时，AuNFs溶液的颜色从浅蓝色变为棕红色，这种变化很容易被肉眼观察到（图2C）。这些结果表明，NH3诱导的银金属化对NH3浓度的变化表现出非常高的敏感性，并且可以用于改变常规ELISA的信号输出，以通过使用酶标仪和肉眼灵敏地检测目标分析物。

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图2.用于诱导金纳米花金属化的不同氨浓度.葡萄糖、AgNO3和AuNFs的浓度分别为0.2 M、10 mM和0.105 nmoL.（A）紫外-可见吸收光谱，（B）作为信号输出的样品峰吸收强度（AM）和空白峰吸收强度（A0）的比率（插图：线性范围，n=3），和（C）对各种浓度氨的多比色测定的照片.

在这项研究中，玻尔兹曼方程比线性模型（r2=0.56，p<0.05）或指数缩减曲线（r2=0.70，p<0.05）能更好地描述从垃圾填埋场到周围土壤淤泥吸附PAE（r2=0.97，p<0.01）（图2b）。这种比较表明玻尔兹曼方法在模拟淤泥吸附PAE的分散方面的有效性，突出了在淤泥吸附PAE的大气传输过程中重力沉降的主导地位。

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结论

在本研究中，脲酶诱导的银金属化首次被用作比色ELISA的信号输出。由于从棕红色到浅蓝色的生动颜色变化（即使对于低至40 pg/mL的OTA浓度），所提出的方法对肉眼OTA定性检测显示出高灵敏度。该系统还可用于通过酶标仪进行OTA定量测定，并且显示出灵敏度比常规的基于HRP的ELISA高至少一个数量级。此外，所提出的方法显示出对其他常见真菌毒素的优异选择性和对不同真实食品样品的稳健性。总之，所提出的策略显示了制造用于定性和定量测定真菌毒素或其他污染物的商业比色ELISA试剂盒的潜力，特别是在资源有限的国家。

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原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.snb.2018.01.193

来源：新污染物检测与筛查评估